達爾文22年來尋找論證, 目的是令自己的學說更牢固, 更有力. 他對不同物種進行多種研究, 好似用了八年時間對藤壺做分類, 成為知名的藤壺專家. 又用自己的後院蓋鳥舍, 飼養不同種鴿子, 並解剖不同品種的鴿子, 試圖比較牠們相似之處, 以證明牠們是由野鴿演化過來. 他還研究了貓, 馬, 豬, 兔, 鴨等家畜, 仔細檢查各種標本以證明天擇所造成的物種變種的存在. 但對生物演化最具啟發性的經歷, 要數到在小獵犬號.
1831年至1836年, 22歲的達爾文以博物學家身分登上英國皇家海軍小獵犬號航行. 當時小獵犬號是到南美洲探險, 並繪畫南美洲地圖, 包括港口及海岸線. 當時達爾文之所以受到邀請, 只是為了擔任袴紈子弟船長的晚餐同伴. 不過, 達爾文卻當了一個稱職的博物學家. 這次航行, 小獵犬號從英國海港出發, 經過薩爾瓦多, 里約熱內盧, 布蘭卡港, 褔克蘭群島, 亞他加馬沙漠, 卡瑤及加拉巴哥群島半個南美洲, 而達爾文花了不少時間在陸上, 探索阿根廷的彭巴草原部份地區, 亞他加馬沙漠和安第斯山脈, 並帶走大量標本及化石.
1832年9月, 小獵太號在布蘭卡港停留一個多月. 彭巴草原與港口緊緊相連, 獵人們負責狩獵食材, 有鹿, 蹄鼠, 犰狳(外型似穿山甲的有殼哺乳類土穴居動物, 背上有骨質鱗甲覆蓋, 可以自由伸縮, 腹部只有毛, 體型與刺蝟差不多), 還有美洲鴕(當時達爾文暫稱牠為鴕鳥). 在達爾文的日記上, 除了仔細敘述美洲鴕和犰狳的外觀, 更描述美洲鴕味道似牛肉, 而犰狳則似鴨肉. 幾天後, 達爾文乘小艇到有蘭卡港下方的旁塔亞塔. 在那裡發現了巨大的未知哺乳類生物化石, 而且數量眾多. 達爾文從中挖出九個化石, 並判定是已絕種的動物, 為美洲特有種.
一個月後, 在旁塔亞塔上方, 叫蒙特埃莫索的地方, 發現了數種齧齒類動物化石. 牠們縱使相似, 但不是一模一樣. 其後, 在阿根廷海岸更南的方向, 又發掘一隻駱駝科的絕種動物化石, 後弓獸(後期改上的名字). 當時達爾文認為這化石是演化出原駝及瘦駝, 還有化種的駱馬和羊駝的源種.
幾個月後, 小獵犬號去到巴塔哥尼亞北部附近. 達爾文認識了幾位牛仔, 並從他們口中得知有一種罕見鴕鳥(另一種美洲鴕), 及後某位船員射殺到一隻. 起初達爾文只當是幼鳥, 後來腦海一閃, 才驚覺這隻就是牛仔們口中的罕見鴕鳥. 幸好他及時收集了殘骸, 送到英國製成標本, 在博物館處展出.
小獵犬號完成南美調查工作後, 又用了一年時間環遊世界, 在1836年10月回到英國. 那時27歲的達爾文已經是一位資深的博物學家, 更帶回了大批化石及標本. 包括5436件涵蓋27種不同種的老鼠的皮, 骨和屍體, 鳥類標本包括美洲鴕和小嘲鶇等, 十多個石化的完整及零碎遺骸, 還有爬蟲類標本. 他把這些東西交給當時的專家, 鳥類學家約翰．古爾德(John．Gould); 年輕的解剖學家, 後來成為哺乳類動物的權威理察．歐文(Richard．Owen)及動物學家湯瑪斯．貝爾(Thomas．Henry．Huxley)去研究分析.
而達爾文本人則整理是次航行的資料, 開始不斷思考. 在那九個石化標本中的如象般大的地懶的許多身體構造和特徵, 與現存在中南美洲的樹懶相似. 還有在一個類似犰狳的巨獸化石留下的由小型骨質鱗甲緊密而成的背甲, 與另外三種大地懶及一種馬的身體特徵非常相似. 當時存在於南美洲的20種犰狳中, 就有幾種在彭巴草原. 這些發現都啟發了達爾文在物種的相似性及彼此接近的思考.
而那兩種鴕鳥, 讓達爾文好奇的地方在於牠們生活在沒有重疊的地理環境上, 又有相似的特徵. 這與他在加拉巴哥群島處收集了十餘種的棕色鳥, 象龜及小嘲鵣所看到的多樣化模式不謀而合, 令他想到演化. 這些化石與現存於南美洲的動物有著有趣而微妙的關係.
1837年, 亦即是從小獵犬號回來後的一年半時間裡, 以一棵生命樹及細枝來表達各個物種演變, 肯定了一個物種是會變成另一個物種. 在檢視帶回來的標本中, 以”蛻變”來形容演化過程. 期後納入了人口理論學家馬爾薩斯(Thomas．Robert．Malthus)中的過度繁殖與生存競爭的內容, 得出了天擇. 1845年, 在第二版的《小獵犬號航海記》中曾暗示他看到的演化現象, 但並無清楚說明. 在二十年時間裡, 他不斷反覆證明其理論的真確性, 直至1853年11月《物種起源》一書問世, 才讓人得知:
萬物在不同的環境底下, 為生存進行前進性演化去適應身邊的環境. 所有物種因食物及空間有限, 會大量繁殖, 用以同類物種進行生存競爭, 剩餘的便是夠強大的天擇中的勝利者. 某些物種在有限的資源底下遷徙, 並慢慢蛻變出適應其地環境生存所需的工具. 演化出來的新物種和舊有物種有許多相同的特徵, 卻不再是同類物種, 更不能交配(趨異原則). 在這個緊密結盟的情況下, 物種不斷的進化. 為了生存, 捕食者與被食者亦會為求存而互相進化, 彼此適應, 共同演化.
《物種起源》一出版便火速售罄, 可是當時許多科學家及神職人員拒絕接受書中的證據和論點達數十年之久. 直到1940年左右遺傳學的出現, 才有人認同達爾文的進化論. 隨著科技的進步, 真理越辯越明, 某些錯誤亦得以糾正, 讓進化論更有說服力, 更嚴謹, 亦為後世的追隨者指出明確的道路.
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